Изучение ДНК в аденомах коркового слоя надпочечников с помощью проточной цитофлуорометрии

Автор: Т.И. ДЭПЮИ, доктор медицинских наук, врач высшей квалификационной категории.

Проведено изучение плоидности, числа клеток в G0/1, S, G2+M фазах клеточного цикла и пролиферативной активности в аденомах коркового слоя надпочечников НП в зависимости от их морфологического строения.

Более трех столетий прошло с тех пор, как в 1716 году Academic des Sciences de Bordeaux предложила премию за ответ на вопрос о роли НП в организме человека, положив начало активным научным исследованиям в этой области.

Однако до сих пор вопрос о существовании корреляции между биологическими параметрами опухоли и ее клиническим «поведением» остается открытым. Известно, что в пределах даже одной и той же гистологической формы опухоли разные морфологические признаки могут существенно варьировать.

Впервые понятие «прогрессия опухоли» введено Fulds L.(neoplastic development - New York, 1976) для обозначения количественных изменений в ткани новообразования. Многие работы последних лет посвящены изучению патологических процессов с помощью оценки количественно-качественных параметров.

При этом совершенствование техники способствовало появлению и развитию нового направления — количественной цитологии. Особенно широкое применение получил метод лазерной ДНК проточной цитофлуорометрии. С помощью которого определяют содержание ДНК в клетках опухоли, ее плоидность, соотношение клеток в различных фазах клеточного цикла; все это помогает исключить субъективизм при оценке особенностей пролиферации и содержание ДНК в ядрах опухолевых клеток.

Известно, что в нормальной неделящейся клетке ДНК представлено диплоидным набором хромосом, а число клеток по фазам клеточного цикла остается постоянным.

При патологических процессах, особенно в опухолях, ДНК не всегда представлено диплоидным набором хромосом и может отклоняться в сторону анеуплоидии, гиперплоидии, тетраплоидии. Появление таких "нетипичных" признаков может служить дополнительным критерием злокачественного процесса, а увеличение числа клеток в различных фазах клеточного цикла и индекса пролиферации (ИП) свидетельствует о высокой пролиферативной активности опухоли.

В последнее время появились данные о применении метода лазерной проточной цитофлуорометрии для исследования содержания ДНК в клетках опухолей при раке молочной железы, легкого, мочевого пузыря, опухолях яичников и т.д. При этом установлена прямая корреляция плоидности и степени злокачественности опухоли, что считается объективным параметром прогноза.

Был проведен анализ взаимосвязи между числом клеток опухоли в S—фазе клеточного цикла и стадии заболевания. Сделан вывод об увеличении процентного содержания клеток в S-фазе в более далеко зашедшей стадии заболевания.

Цель работы — изучить плоидность, число клеток в различных фазах клеточного цикла (G0/1,S,G2+M) методом ДНК-проточной цитофлуорометрии у больных с гормональноактивной (ГА) и гормональнонеактивной (ГНА) аденомой коры НП.

Материал и методы

Исследование включало 26 пациентов с доброкачественным объемным образованием коркового слоя НП. По статистике, заболевание НП чаще выявляется у женщин (1:3). Аденома коры НП выявлена у 19 (73,1%) женщин и у 7 (26,9%) мужчин. Возраст пациентов колебался от 23 до 54 лет (средний возраст 38 лет).

При изучении гормональной активности аденомы коры НП выявлено 11 (42,3%) пациентов с повышенным уровнем НП гормонов: альдостерома — 4 случая, кортикостерома — 4, андростерома — 3 случая. Максимальное число 15 (57,7%) пациентов представлено ГНА аденомами НП.

Хирургическое лечение выполнено всем пациентам в т. ч. проведено 17 адреналэктомий открытым способом, 9 адреналэктомий — видеолапароскопическим методом. Материалом для исследования служила ткань хирургического удаленного НП.

По морфологической характеристике все доброкачественные образования НП были аденомами с различной степенью соотношения светлых и темных клеток. В зависимости от степени дифференцировки аденомы, пациенты разделены на три группы: I гр. – светлоклеточные аденомы, II гр. – темноклеточные аденомы и III гр. - смешанноклеточные аденомы.

Исследование ДНК производили на лазерном проточном цитофлуорометре FACScan (Becton Dikinson, США). В основе — метод проточной цитометрии, впервые описанный Кросландом-Тейлором и позволяющий получить ламинарный поток образца (Normal A.,1980). Метод обеспечивает высокую точность измерений и позволяет анализировать десятки тысяч клеток за считанные секунды. В качестве источника излучения использован аргоновый лазер (Laerum O.D., et al., 1987; Koss L.G. et al., 1989).

Полученные данные о плоидности и числа опухолевых клеток в фазах цикла (Phoenix Flow Systems,США 1994) анализировали при помощи программы «Multicycle», или программы «Cell Fit» (Becton Dikinson, США, 1992).

В ДНК-гистограмме процент клеточных ядер с различным содержанием ДНК исчисляли по отношению к общему числу исследованных клеток. Содержание клеток по фазам клеточного цикла выражали в процентах. В качестве диплоидного стандарта использовали лимфоциты крови здоровых доноров.

Если на ДНК-гистограмме присутствовал один пик (соответствующий диплоидному содержанию ДНК в ядрах), то опухоль считали диплоидной.

Если ДНК-гистограмма содержала наряду с диплоидным или без него один пик, отличающийся по содержанию ДНК от диплоидных клеток, то такую клеточную популяцию рассматривали как анеуплоидную.

Для характеристики анеуплоидии применяли индекс ДНК (ИДНК), который вычисляли как соотношение интенсивности флуоресценции пика анеуплоидных клеток к пику диплоидных клеток опухоли. ИДНК диплоидных клеток (2с) принимали за единицу, ИДНК анеуплоидных клеток был больше или меньше 1,0.

Также изучали показатель «пролиферативной активности опухоли» или индекс пролиферации (ИП), который вычисляли как сумму клеток, находящихся на момент исследования в S и G2+M фазах клеточного цикла. В соответствии с плоидностью и проли-феративной активностью клеток. С учетом данных Auer G. И соавторов (1980); Meyer J.S. и соавторов (1984); Hedley D. И соавторов (1987) выделено 2 основных типа ДНК-гистограмм: первый тип цитограммы у больных с диплоидным содержанием ДНК в клетках опухоли (ИДНК=1,0); второй тип включал гистограммы у больных анеуплоидией в переделах митотического цикла (ИДНК от 1,1до 1,84).

Небольшое число пациентов не позволило провести статистический анализ, поэтому результаты были описательными.

Результаты

При оценке результатов ДНК-проточной цитофлуорометрии выявлена неоднородность аденом коры НП. В 18 (69,2%) случаях клетки аденомы были диплоидными (ИДНК=1,0), а в 8 (30,8%) наблюдениях — ануеплоидными содержание ДНК (ИДНК от 1,1до 1,4).

Среди диплоидных аденом НП ГНА аденомы – 11 (64,7%) из 17.

У остальных 6 (35,3%) пациентов с диплоидным содержанием ДНК в аденоме выявлена гормональная активность, в том числе – 3 альдостеромы, 2 кортикостеромы,
1 андростерома.

В группе «анеуплоидных» опухолей (8 пациентов) было 5 ГА аденом (1 альдостерома, 2 кортикостеромы, 2 андростеромы) и только 3 ГНА аденомы.

Таким образом, не все доброкачественные аденомы коры НП имели диплоидное, а значит прогностически благоприятное со-держание ДНК в клетках опухоли. У 30% пациентов с ГА и ГНА аденомами коры НП выявлено анеуплоидное содержание ДНК, однако ИДНК в этих опухолях составил от 1,1 до 1,4, что не выходило за пределы митотического цикла и делало клинический прогноз более оптимистическим.

На основании плоидности ДНК 26 пациентов с ГА и ГНА аденомами коры НП были разделены на две подгруппы в зависимости от гистологической принадлежности:

Диплоидные опухоли (18 пациентов):

  • светлоклеточная аденома — 4 случая (3 альдостеромы и 11 ГНА аденом);
  • смешанноклеточная аденома — 4 случая (2 кортикостеромы, 1 андростерома, 1 ГНА аденома).

Анеуплоидные опухоли (8 пациентов):

  • светлоклеточная аденома — 1 альдостерома;
  • смешанноклеточная аденома — 5 случаев (2 андростеромы, 3 ГНА аденомы);
  • темноклеточная аденома — 2 кортикостеромы.

В таблице представлены показатели клеточного цикла в зависимости от гистологического строения аденомы коры НП.

Распределение клеток по фазам клеточного цикла при диплоидном и анеуплоидном типе аденомы коры надпочечников

Образование
надпочечника
Фаза клеточного цикла ИП (%)
G0/1(%) S(%) G2+М(%)
I. Диплоидные(n-18)
1. Светлоклеточная аденома (n-14) 92,9 2,8 4,3 7,1
2. Смешанноклеточная аденома (n-4) 88,7 6,5 4,8 11,3
II. Анеуплоидные (n-8)
1. Светлоклеточная аденома (n-1) 91,7 4,7 3,6 8,3
2. Темноклеточная аденома (n-2) 84,4 6,1 9,5 15,6
3. Смешанноклеточная аденома (n-5) 87,4 5,8 4,7 10,6

* все результаты представлены как среднее арифметическое (М), в сязи с малым числом наблюдений.

n — число наблюдений;
ИДНК — индекс ДНК - степень хромосомных нарушений опухоли (соотношение ДНК анеуплоидных клеток к ДНК нормальнм клеткам);
G 0/1 — число клеток в фазе G 0/1 ( G0-состояние покоя, G1- синтез РНК);
S — число клеток в S-фазе клеточного цикла (ДНК+РНК готовых к делению);
G2+M — число клеток в премитозе;
ИП — индекс пролиферации — совокупность параметров S+(G2+М)

Полученные результаты свидетельствовали о наличии отличий по числу клеток в S, G2+M фазах, а так же ИП в зависимости от гистологического строения аденом коры НП.

В диплоидной и анеуплоидной светлоклеточных аденомах: S-2,8% и 4,7%, G2+М- 4,3% и 3,6%, ИП-7,1% и 8,3% соответственно. Пролиферативная активность в светлоклеточных аденомах не зависела от плоидности и была низкой. Не отмечено так же корреляции между пролиферативной и гормональной активностью аденомы.

В смешанноклеточных аденомах коры НП, как диплоидного так и анеуплоидного типе, выявлено увеличение клеток в различных фазах клеточного цикла (S- 6,5% и 5,8%; G2+M -4,8% и 4,7%, ИП-11,3% и 10,6% соответственно). Результаты свидетельствовали о повышенной пролиферативной активности смешанноклеточных аденом, по сравнению со светлоклеточными опухолями.

Наибольшая пролиферативная активность определена в темноклеточных анеуплоидных аденомах НП: S-6,1%, G2+М- 9,5% и ИП-15,6%. В группу с темноклеточными анеуплоидными аденомами включены двое пациентов с кортикостеромами НП. По гистологическим признакам обе кортикостеромы имели доброкачественное строение. Однако, учитывая выраженную пролиферативную активность клеток опухоли прогностическую возможность озлокачествления кортикостером следует пасматриваиь как высокую.

Таким образом, в группах с различным морфологическим строением аденом НП (светло-, темно- и смешанноклеточные) отмечены различия в количестве клеток в S и G2+М фазах клеточного цикла, а также ИП.

Пролиферативная активность в светлоклеточной аденоме независимо от плоидности была низкой. Корреляциия между пролиферативной и гормональной активностью в этом типе аденомы НП не выявлена. Эти данные свидетельствуют о благоприятном в светлоклеточной аденомы коры НП.

Наиболее высокая пролиферативная активность выявлена в смешанноклеточных и особенно темноклеточных аденом коры НП. В сочетании анеуплоидией это позволяет предположить высокую потенциальную возможность их озлокачествления.